Главная › Психология › Методы биотестирования природных и сточных вод.

Методы биотестирования природных и сточных вод.

Биотестирование-метод оценки качества среды обитания (токсичности веществ) с помощью опытов с тест объектами.в пробы природной воды помещают определенное кол-во (обычно 10) тест-объектов и по истеч. Некоторого времени сравнивают с контролем.(на примере дафний: для определения острой токсичности необходимо 4 дня,для хронической токсичности -20-24 дня.)пробу донных отложений высушивают,делают вытяжку,дальше все по схеме с дафниями

Биотестирование в оценке токсичности сточных вод

При исследовании сточных вод на токсичность не допускается отбор разовой пробы.кол-во необходимых порций выбирают на основе опыта проведения анализа(согласно методическим указаниям и ГОСТам)обычно отбирают пробы каждый час в течение суток,потом все тщательно перемешивается и для биотестирования берется необходимое количество воды.пробы,взятые для исследования токсичности нельзя консервировать.и тут все как в 1-м вопросе: две банки с исследуемой водой и контроль

Биотестирование в оценке токсичности химических веществ. Показатели токсичности (LC50, LD50 и др.)

Токсичность химических веществ определяется летальной дозой(для теплокровных тест-объектов) и летальной концентрацией(для водных). LC50(лет.конц.)-такая конц в-Ва, которая вызывает гибель 50% тест ор-мов за установленное время.в качестве тест-объектов используются и водоросли,для них невозможно определить LC50, поэтому для них используется показатель IC50 (ингибирующая концентрация-замедление прироста культуры).для определения токсичности хим в-ва его разводят в воде в соотношении 1/10,1/100,1/1000. Берут 2 пробы (банки) и контроль.по истечению указанного времени сравнивают пробы с контролем, подбирается такая конц в-ва,чтоб точно определить LC50

Тест-организмы, используемые в биотестировании. Критерии выбора тест-организмов

Тест-объект - организм,используемый при оценке токсичности веществ,донных отложений,вод и почв.это специально выращенный в лабораторных условиях организм,разной систематической принадлежности (крысы,водоросли,простейшие,рыбки) Требования к ним: генетически однородны(чистые линии),адаптированы к лабораторным условиям,в идеале,реакция не должна зависеть от сезонных и суточных циклов.набор тест объектов определяется методиками

Тест-функции

Тест-функция - критерий токсичности,используемый в биотестировании для характеристики отклика тест-объекта на повреждаюшее (негативное) действие среды. Напр.: смертность/выживаемость(обычно исп. для простейших,насекомых,ракообразных,рыб),плодовитость/кол-во потомства,время его появления,появление аномальных отклонений.для растений- скорость прорастания семян,длинна первичных корешков и т.п.

Основные критерии оценки токсичности по результатам биотестирования

Токсический эффект- изменение любых показателей жизнедеятельности под воздействием токсикантов,зависит от особенностей в-в. При гибели в пробе <10% от контроля можно говорить о том,что среда не токсична.10-50% - среда безвредна.> 50% - среда токсична

Отбор, транспортировка проб, подготовка их к биотестированию

Для получения достоверной информации о токсичных свойствах пробы, ее необходимо правильно отобрать и хранить до выполнения теста.Используя карту или схему реки, выбирают места отборов проб (станции). Для более точной оценки качества воды на каждой станции отбираются несколько проб. Проба отжимается и переносится в пластиковый контейнер.биотестирование проб воды проводят не позднее 6 часов после их отбора.при длительной перевозки пробы возможно снижение ее температуры до +4 градусов

Особенности острых и хронических опытов по биотестированию

тест на острую токсичность выражается в гибели организмов за определенный промежуток времени (то нескольких секунд од нескольких суток).Хроническая токсичность проявляется только через несколько суток и,как правило,не ведет к быстрой гибели организма,выражается в нарушении жизненно важных функций,возникновении токсикозов

Катериненко Мария

Исследование качества воды методом биотестирования. Методика определения токсичности различных сред на приборе "Биотестер-2", основана на контроле хемотаксической реакции инфузории-туфельки.

Скачать:

Предварительный просмотр:

Исследование качества воды методом биотестирования.

Катериненко Мария. 8 А класс, ГБОУ Школа №359.
Руководитель: Набатова А.В.

Цель работы: Изучить возможности применения биотестирования, как способа оценки качества воды.

Актуальность: Роль воды в жизни человека трудно переоценить. Мозг взрослого человека состоит из воды на 74,5%, кровь - на 83%, в мышцах воды 75,8%, в костях - 22%.

Потеря всего 3% воды организмом лишает человека возможности бегать, 5% - лишает возможности переносить существенные физические нагрузки, а потеря организмом 10% воды представляет опасность для жизни. Метод биотестирования позволяет быстро и сравнительно дешево произвести анализ, устраняя риски, связанные с употреблением некачественной воды.

Задачи исследования:

Знать особенности инфузории туфельки как тест-объекта;
Понимать механизм воздействия на тест-объект и его ответную реакцию;
Уметь проводить эксперимент;
Сравнить реакцию тест-объекта в различных пробах воды;
Оценить полученные результаты и сделать выводы на основе полученных результатов.

Подписи к слайдам:

Исследование качества воды методом биотестирования. Работа выполнена: Катериненко Марией Вадимовной. Класс 8 «А». ГБОУ Школа №359. Руководитель: Набатова А.В.

Цель исследования: Изучить возможности применения биотестирования как способа оценки качества воды.

Задачи исследования: Знать особенности инфузории туфельки как тест-объекта. Понимать механизм воздействия на тест-объект, вызывающий ответную реакцию. Уметь проводить эксперимент.

Задачи исследования: Сравнивать реакцию тест-объекта в различных пробах воды. Оценивать полученные результаты. Делать выводы на основе полученных результатов.

Биотестирование. Биотестирование - это определение степени опасности среды с помощью биологических объектов: водорослей, простейших и пр.

Строение Инфузории туфельки: 1. большое ядро; 2. малое ядро; 3 - реснички; 4 - предротовое углубление; 5 - пищеварительные вакуоли; 6 - порошица; 7 - выделительные вакуоли с приводящими канальцами.

Среда Лозина-Лозинского. Дистиллированная вода - 100 мл; 0,1 г - NaC l ; 0,01 г - КС l ; 0,01 г – СаС l 2 ; 0,01 г - MgC l 2 ; 0,02 г – NaHCO 2 .

Подсчёт Инфузорий Туфелек в капле воды.

Биотестирование.

Итоги исследования:

Вывод: Качество сырой воды дало самые низкие результаты. Кипяченая вода показала самые лучшие результаты. Бутилированная вода - средний показатель. Качество фильтрованной воды не является показательным в данном исследовании.

Список литературы Бухвалов В.,Богданова Л.Экологическая экспертиза.-М.:ЛА Варяг,1995 Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология в 3-т. Под ред. Р. Сопера. – М.:Мир, 1996 Догель В.А. Зоология Беспозвоночных.-М.:Высшая школа,1981 Жизнь животных.Т.1.-М.:Просвещение,1986 Захаров И.С.,Величко А.Н. Исследование возможности применения температурных популяционных реакций инфузорий как информативных показателей вредных факторов в среде.-СПб:ИБРР,2013 Захаров И.С., Пожаров А.В. Биотехнические методы охраны окружающей среды. -СПб: Изд-во СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 2001 Захаров И.С., Пожаров А.В., Сидоренко В.М. Экспрессные методы интегральной оценки экологического состояния объектов окружающей среды. СПб: Изд-во СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 2007. Энциклопедия для детей Т.2.Биология.-М.:Аванта+,1999 http://chemister.ru/Database/words-description.php?dbid=1&id=49 http://www.bioind.narod.ru/Articles/guppi.htm http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%91%D0%B8%D0%BE%D0%B8%D0%BD%D0%B4%D0%B8%D0%BA%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F

Спасибо за внимание!

Значительное время контроль за загрязнением окружающей среды осуществлялся только физико-химическими методами, путем определения концентраций загрязнителей и соблюдением соответствия величин измеренных концентраций нормированных показателей предельно-допустимым концентрациям (ПДК). С развитием химической промышленности, синтезом новых соединений и их использованием в производстве перечень контролируемых загрязнителей в составе сточных вод увеличивается с каждым днем. Сегодня много загрязняющих веществ по разным причинам не контролируется: для одних не разработаны ПДК, для других отсутствуют утвержденные методики определения, а их воздействие испытывает окружающая среда. В результате поучается так, что широкий спектр соединений, токсичных веществ в водной, воздушной и почвенной средах не контролируется. Но и в случае контроля полного спектра соединений в среде на уровне ПДК нельзя утверждать об отсутствии вредного воздействия на окружающую среду. Так как информация физико-химических показателей не позволяет в принципе сделать вывод о совокупном воздействии загрязняющих веществ различной природы на живые организмы и степени их опасности.

Заполнить информационный аналитический вакуум о комбинационном воздействии загрязнителей признаны методы биотестирования. Особенность информации, получаемой с помощью методов биотестирования состоит в интегральном характере отражения всей совокупности свойств испытуемой среды с позиции восприятия ее живых объектом. И в отличии от физико-химических методов, посредством которых определяется валовое содержание того или иного загрязнителя, биотестовые методы анализа качества воды позволяют обнаружить физиологически активные формы соединений, влияющие на организм. Так, например, нет возможности разрабатывать ПДК веществ под различные значения рН среды, а именно изменение рН среды влечет за собой образование иных форм соединений, возможно более токсичных. Или же токсическое действие токсикантов усиливается в мягкой воде нежели чем в жесткой. А комплексное воздействие загрязнителей совсем непредсказуемо.

Изучено и выделены несколько вариантов воздействия токсикантов.

1. Антагонистическое воздействие токсикантов - возможно такое сочетание ионов в комбинации которых эффект токсичности будет меньше.

2. Аддитивный эффект - эффект токсичности суммы токискантов равен сумме эффектов токсичности.

3. Синергический эффект - неполное суммирование эффектов токсичности.

4. Сеисибилизационный эффект - комбинация токсикантов усиливает эффект токсичности.

Сегодня биотестовые методы, как необходимое дополнение к химическому анализу включены в стандарт по контролю качества вод различного назначения.

Принцип биотестирования сводится к регистрации изменения биомассы, выживаемости, плодовитости, а также физиологических или биохимических показателей тест-объекта в испытуемой среде.

В настоящее время в мире используется большое разнообразие тест-объектов: от одноклеточных водорослей, мхов и лишайников, бактерий и простейших микроорганизмов до высших растений, рыб и теплокровных животных.

В России в органах государственного аналитического контроля за качеством воды дафниевый тест рекомендован в качестве основного для контроля токсичности сточных вод и перспективного для оценки уровня токсического загрязнения природных вод. Дафниевый тест обязателен при установлении ПДК отдельных веществ в воде рыбохозяйственных водоемов.

Выбор тест-объекта определен следующим: 1) этот род ветвистоусых рачков распространен повсеместно в пресных водоемах, является важной составной частью зоопланктона, служит источником пищи молоди рыб; 2) легко культивируется в лабораторных условиях - испытания загрязняющих веществ можно проводить в течении года; 3) определяющая особенность -это то, что по характеру питания они являются фильтраторами и прокачивают большие объемы воды, отфильтровывая в качестве пищи бактерий и микроводоросли, поэтому, если в воде присутствует токсикант даже маленькой концентрации из-за объема отфильтрованной воды чувствительность тест-объекта высокая.

Дафниевый метод биотестирования основан на определении изменений выживаемости и плодовитости дафний при воздействии токсических веществ, содержащихся в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Выделяют кратковременное биотестирование - до 96 час. Позволяет определить острое токсическое действие испытуемой воды на дафний по их выживаемости. Показателем выживаемости служит среднее количество особей, выживших в тестируемой воде или в контрольной за определенное время. Критерием токсичности является гибель 50% и более дафний за период времени до 96 час. в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Длительное биотестирование - 20 и более суток - позволяет определить хроническое токсическое действие испытуемой воды на дафний по снижению их выживаемости и плодовитости. Показателем выживаемости служит среднее количество исходных самок-дафний, выживших в течение биотестирования, показателем плодовитости - среднее количество молоди, выметанной в течение биотестирования, в пересчете на одну выжившую исходную самку. Критерием токсичности является достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний.

Выше было упомянуто о большом количестве тест-объектов, использующих в биотестировании и это неслучайно. Дело в том, что различные организмы по разному реагируют на загрязнители. И задача природоохранных органов правильно оценить ситуацию и выбрать более чувствительный тест-объект.

Пример. Результаты биотеетироваиия сточных вод завода,
синтезирущего биологические активные соединения гербицидного
направления, могут быть различными в зависимости от выбранного тест-
обьекта. Дафниевый тест может показать отсутствие токсического
воздействия, а культура водорослей может почувствовать токсикант.
Почему? Дело в том, что предполагаемый токсикант, синтезируемые
гербициды являются ингибиторами процессов фотосинтеза у растений и
водорослей. Поэтому дафнии могут в кратковременном опыте зафиксировать
отсутствие острого токсического воздействия, а водоросли в случае
нарушения работы фотосинтетической цепи оперативно отреагируют на
загрязненность.

Поэтому в системе контроля за качеством сточных вод также рекомендованы водоросли: хлорелла и сцепедесмус. Критерием токсичности при биотестирозании с использованием водорослей служит достоверное снижение количества клеток в испытуемой воде по сравнению с контролем.

С целью быстрого получения информации о качестве воды используются экспресс методы биотестирования.

В Москве разработан и выпускается мелкими.партиями прибор "Биотоке". Устройство Биотоке - это портативный биолюминометр,

позволяет с помощью биосенсора "Эколюм", светящиеся бактерии, производить быстрое и объективное определение индекса обшей токсичности водных образцов, включая металлы, препараты бытовой химии и т.д. Результаты токсичности пробы воды получают через 10 мин.

В Санкт-Петербурге выпускается прибор Биотестер. В качестве тест-объекта используют одноклеточные микроорганизмы - инфузории туфелька. Этот метод основан на хемотаксической реакции организмов в ответ на загрязнитель, т.е. движение культуры в благоприятную зону. Данная тест-реакция - хемотаксис, является очень чувствительной к токсикантам определенной группы.

В России биотестирование проводят аналитические лаборатории органов природоохраны для определения токсичности сточной воды (происходят ли патологические изменения или гибель организмов, обусловленные присутствием в ней токсических веществ) на сбросе в водный объект, воды в контрольном и других створах водопользования с целью проверки соответствия качества воды нормативным требованиям:

Сточная вода на сбросе в водный объект не должна оказывать острого токсического действия, а вода в контрольном и других створах водопользования - хронического токсического действия на тест-объекты.

В соответствии с "Методическим руководством по биотестированию воды РД 118-02-90", биотестирование является дополнительным экспериментальным приемом для проверки необходимости корректировки величин ПДС по интегральному показателю "токсичность воды", который позволяет учесть ряд существенных факторов: наличие в сточной воде токсических веществ, неучтенных при установлении ПДС, вновь образованных соединений, метаболитов, различные виды взаимодействия химических веществ. Необходимость корректировки величин ПДС возникает в том случае, если при биотестировании воды из контрольного створа водного объекта установлено несоответствие ее качества требуемому нормативу: вода в контрольном створе водного объекта не должна оказывать хронического токсического действия на тест-объекты (дафний и цероидафний).

Для оценки бактериального загрязнения используются санитарно-бактериологические и гидробиологические показатели.

Микронаселение природных вод чрезвычайно разнообразно. Его качественный и количественный состав определяется в первую очередь составом воды. Для глубоко залегающих, очень чистых артезианских вод характерно почти полное отсутствие бактерий вследствие защищенности водоносного слоя от контакта с лежащими выше горизонтами.

Особенностью состава воды открытых водоемов является изменение его по сезонам года: сопровождающееся изменениями в количестве и видовом разнообразии микронаселения. Бактериальная загрязненность поверхностных источников обусловлена, главным образом, поступлением в водоемы поверхностного стока, содержащего органические, минеральные вещества и микроорганизмы, смываемые с площади водосбора, и сточных вод.

С позиций санитарной микробиологии оценка качества воды проводится
с целью определения ее санитарно-эпидемиологической опасности или
безопасности для здоровья-человека. Вода играет важную роль в передаче
возбудителей многих инфекций; главным образом кишечных. Т.к. через воду
получают распространение брюшной тиф, дизентерия, холера,
инфекционный гепатит и т.д.

Прямое количественное определение возбудителей всех инфекций для контроля за качеством воды неосуществимо в связи с многообразием их видов и трудоемкостью анализа. В практической санитарной микробиологии поэтому прибегают к косвенным методам, позволяющим определить потенциальную возможность заражения воды патогенными микроорганизмами.

Санитарно-бактериологическая оценка качества воды основана на определении двух основных показателей; микробного числа и числа бактерий группы СоН.

Первый показатель даст представление об общей обсемененности воды аэробными сапрофитами, поэтому часто называется общим счетом аэробных сапрофитов или (кратко) общим счетом. Микробное число определяют методом посева на стандартную среду - мясопептонный агар (МПЛ).

Аэробные сапрофиты составляют только часть общего числа микробов в воде, но являются важным санитарным показателем качества воды, так как между степенью загрязнения ее органическими веществами и микробным числом существует прямая зависимость. Кроме того, полагают, что чем выше микробное число, тем больше вероятность присутствия в воде патогенных микроорганизмов. Микробное число водопроводной воды не должно превышать 100. В природных водах этот показатель изменяется в очень широких пределах для разных водоемов и по сезонам года для одного и того же водоема. В чистых водоемах число аэробных сапрофитов может исчисляться десятками или сотнями, а в загрязненных и грязных водоемах составлять десятки тысяч и миллионы.

По второму показателю - числу бактерий группы СоН (кишечная палочка) оценивают возможное присутствие в воде патогенных микроорганизмов.

Бактерии группы СоН относятся к семейству энтеробактерий. Это неспороносные палочки, факультативные анаэробы, сбраживающие лактозу и глюкозу при температуре 37°С с образованием кислоты и газа и не обладающие оксидазной активностью. Они являются постоянными сожителями кишечника человека и животных: постоянно и в большом числе выделяются во внешнюю среду; дольше, чем патогенные микроорганизмы, сохраняют жизнеспособность в этой среде; более устойчивы к хлору, чем возбудители большинства инфекций. Именно эти свойства бактерий группы СоИ обусловили возможность их использования в качестве санитарно-показательных микроорганизмов. Наличие коли-форм в воде говорит о ее фекальном загрязнении, а их число позволяет судить о степени этого загрязнения. Для количественного определения коли-форм применяют фуксин-сульфитный агар (среда Эндо).

Анализ водопроводной и чистой природной воды проводят после предварительного концентрирования воды на мембранных фильтрах.

Результаты выражают в виде коли-индекса - числа бактерий в 1 л воды.

Иногда делают пересчет, определяя коли-титр - наименьший объем воды (в мл), содержащий одну кишечную палочку. Коли-титр = 1000/коли-индекс.

Коли-индекс водопроводной воды должен быть не более 3. Допустимый коли-индекс воды источников водоснабжения зависит от предполагаемого способа очистки. Если намечается только хлорирование воды, то коли-индекс воды в источнике не должен превышать 1000 при полной очистке воды - 10000.

В особых условиях по санитарно-эпидемиологическим показателям прибегают к определению в воде - энтерококков, энтеровирусов сальмонелл и проводят исследования воды на патогенную микрофлору.

Поверхностные источники водоснабжения помимо санитарно-бактериологических тестов характеризуются также данными гидробиологических наблюдений. Микроскопированием пробы воды определяется число клеток фито- и зоопланктона. Эти показатели существенно изменяются по сезонам - как по количеству организмов, так и по их видовому разнообразию.

В весенне-летний период интенсивного развития водорослей (цветения водоема) содержание фитопланктона в поверхностных водах может достичь 50 тыс. клеток в 1 мл. Летом зоопланктон отличается большим разнообразием и представлен низшими ракообразными, коловратками, личинками моллюсков. В воде могут оказаться и бентосные организмы: черви, личинки насекомых. В зимний период в воде встречаются, в основном, низшие ракообразные. Число организмов зоопланктона обычно выражают числом экземпляров в 1 м3 воды. В воде источников встречаются также организмы, видимые невооруженным глазом. Их число оценивают числом экземпляров в 1 м3. Для рек средней полосы европейской части нашей страны концентрация зоопланктона составляет 100- 10000 экз. в 1 м воды. Обычно их в несколько раз меньше, чем организмов зоопланктона.

В питьевой воде планктонные организмы, так же как организмы видимые невооруженным глазом, должны отсутствовать.

ЦОС ПВ Р 005-95

Документ разработан авторским коллективом в составе: Рахманин Ю.А., Ческис А.Б. (руководители разработки), Еськов А.П., Кирьянова Л.А., Михайлова Р.И., Плитман С.И., Роговец А.И., Тулакина Н.В., Русанова Н.А., Донерьян Л.Г., Пожаров А.В.

В приложениях использованы материалы Методического руководства по биотестированию воды РД 118-02-90* и методических документов по применению прибора "БИОТЕСТЕР", а также "Методики контроля токсичности медицинских изделий однократного применения, стерилизованных радиационным или газовым методом" (МЗ СССР, 1991 г.).

________________
* Документ, упомянутый здесь и далее по тексту, не приводится. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке

Представлен: Техническим комитетом по стандартизации ТК-343 "Качество воды"

Внесён: Управлением стандартизации и сертификации пищевой, лёгкой промышленности и сельскохозяйственного производства Госстандарта России

Утверждён: Заместителем Председателя Госстандарта России 12.10.95 г. для издания и распространения в качестве методического справочного пособия.

Зарегистрирован: Центральным органом по сертификации питьевой воды, материалов, технологических процессов и оборудования, применяемых в хозяйственно-питьевом водоснабжении N ЦОС ПВ Р 005-95

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

В условиях постоянно нарастающего антропогенного загрязнения источников водоснабжения обеспечение безопасности и безвредности питьевой воды, поставляемой населению предприятиями водоснабжения, в значительной мере зависит от полноты, достоверности и оперативности контроля качества воды во всех технологических звеньях системы: в контрольных створах водных объектов, в местах водозаборов, в ёмкостях чистой воды после ее очистки и обеззараживания, в распределительной водопроводной сети у потребителей. При этом число нормируемых и контролируемых параметров качества, в совокупности определяющих безопасность и безвредность воды, увеличилось за последнее десятилетие более, чем в два раза и в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) включает более 100 нормативов. Высокая токсичность и соответственно низкие значения предельно-допустимых концентраций (ПДК) для ряда тяжелых металлов и большинства органических токсикантов существенно усложняют процедуры аналитического химического контроля, требуют продолжительного времени и весьма значительных материальных затрат на проведение комплексного контроля качества воды. Кроме того, проведение даже полного анализа качества воды по всем установленным в нормативных документах индивидуальным показателям не дает возможность определить их комплексное воздействие на организм человека, а принятие системы суммирования относительных концентраций не отражает в полной мере механизм совокупного воздействия токсикантов на степень опасности потребляемой человеком воды.

В связи с этим наряду с традиционными методами для контроля качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения могут применяться методы биологического тестирования, основанные на оценке степени опасности воды источников водоснабжения и питьевой воды по реакции специально подготовленных живых организмов - тест-объектов.

Особенность информации, получаемой с помощью методов биотестирования, состоит в интегральном характере восприятия и отражения всех токсических воздействий, обусловленных совокупностью содержащихся в воде токсикантов и комплексных факторов их совместного присутствия.

При этом применение различных методов биотестирования должно быть ограничено определенными условиями в отношении целей контроля, места отбора проб воды, степени оперативности и т.п., в зависимости от специфических характеристик каждого конкретного метода. Возможно комплексное использование различных биотестов, взаимно дополняющих друг друга по чувствительности к различным группам токсикантов.

Во всех случаях использование методов биотестирования не может заменить аналитический физико-химический контроль, установленный действующими нормативными документами, однако биотесты могут существенно дополнить его результаты оценкой комплексного воздействия содержащихся в воде токсикантов, повысить оперативность обнаружения опасных уровней загрязнения источников питьевого водоснабжения для принятия экстренных мер по вводу резервных мощностей очистки или предупреждения потребителей, а также в ряде случае позволить увеличить периодичность отбора проб для физико-химического контроля и соответственно снизить затраты на контроль при подтверждаемом биотестами сохранении стабильных показателей уровня безопасности исходной воды в источнике водоснабжения.

Настоящий документ устанавливает общие методические рекомендации по применению различных методов биотестирования в централизованных системах хозяйственно-питьевого водоснабжения для решения конкретных задач по контролю качества воды в источниках водоснабжения и очищенной воды, подаваемой потребителям в сочетании с традиционными методами физико-химического контроля.

Методические рекомендации предназначены для использования предприятиями водоснабжения и водоотведения в целях совершенствования систем контроля качества воды, повышения его надежности и оперативности, а также могут быть использованы органами Госкомсанэпиднадзора России при выполнении надзорных функций за качеством воды источников водоснабжения и качеством питьевой воды для повышения достоверности оценки безопасности (безвредности) контролируемой воды в отношении комплексного воздействия находящихся в ней токсикантов.

ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ВОДЫ В СИСТЕМАХ ХОЗЯЙСТВЕННО-ПИТЬЕВОГО ВОДОСНАБЖЕНИЯ

Основными характеристиками методов биотестирования, определяющими цели и условия их возможного использования в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения, являются:

- вид тест-объекта;

- контролируемый параметр тест-объекта (тест-реакция);

- процедуры измерения тест-реакции;

- оценочные нормативы для определения степени опасности контролируемой среды (воды) для человека по замеренным параметрам тест-реакции.

В качестве тест-объектов в современных методах биотестирования для контроля безопасности (безвредности) воды могут быть использованы рыбы, ракообразные (дафнии и др.), инфузории, зародышевые организмы, водоросли, ферменты, бактерии и др.

Основные требования к тест-объектам состоят в их доступности, простоте и удобстве культивирования или хранения для использования, достаточной чувствительности к содержащимся в воде токсикантам, опасным для человека.

Тест-реакция тест-объекта при воздействии токсикантов или других неблагоприятных факторов окружающей среды может выражаться в гибели тест-объектов (выживаемости), снижении интенсивности размножения, снижении подвижности или других поведенческих характеристик, типичных для данного тест-объекта, а также в подавлении некоторых биохимических процессов, протекающих в клетках и ферментных системах.

Основные требования к тест-реакциям при выборе методов биотестирования для практического использования состоят в наличии ясно выраженной зависимости фиксируемых отклонений от нормы от концентраций токсикантов в воде, а также в возможности наблюдения и регистрации количественных значений тест-реакций с необходимой точностью и достоверностью при использовании доступных средств контроля.

Основные требования к процедурам измерения тест-реакций при использовании методов биотестирования для контроля качества воды в системах водоснабжения состоят в возможности получения требуемого "отклика" на появление в воде опасных токсикантов в максимально сжатые сроки. Это, как правило, требует использования специальных контролирующих устройств с элементами автоматизации, обеспечивающими преобразование регистрируемых тест-реакций в нормируемые величины характеристик токсичности воды.

Методы биотестирования, в которых процедуры измерения тест-реакции рассчитаны на длительный период наблюдения, могут найти ограниченное применение на стадии обследования и выбора источника водоснабжения для хозяйственно-питьевых целей или при наблюдении за источниками водоснабжения с заведомо стабильным качеством воды.

Оценочные нормативы при использовании методов биотестирования должны позволять на основе полученных результатов замеров сделать заключение о степени опасности воды и о принятии при превышении допустимых норм опасности (токсичности) воды необходимых мер по предотвращению возможной угрозы здоровью населения, потребляющего питьевую воду из данной системы водоснабжения.

В настоящее время в действующих нормативных документах отсутствуют утвержденные нормированные величины предельно-допустимых комплексных токсических воздействий, измеряемых с помощью методов биотестирования.

В связи с этим для каждого конкретного метода биотестирования в результате специальных исследований устанавливают корреляционные связи фиксируемых значений тест-реакций с возможным токсическим воздействием на теплокровных животных или с концентрациями конкретных токсикантов и на этом основании вводят определенные оценочные значения степени токсичности (опасности) контролируемой воды в зависимости от фиксируемых результатов измерений при биотестировании.

При этом следует иметь в виду, что эти оценочные значения не являются критериями опасности или безопасности воды при использовании ее человеком для питьевых целей в течение длительного времени; они могут только указывать на вероятность наличия или отсутствия в воде опасных концентраций токсических загрязнений, что должно подтверждаться результатами соответствующего химического контроля, на основании которого с учетом действующих ПДК делается заключение о соответствии питьевой воды установленным требованиям и ее пригодности для использования людьми.

Вместе с тем, в сравнительном плане при оценке, например, различных технологий очистки воды, обеспечивающих ее соответствие нормативным требованиям по отдельным видам токсикантов, предпочтение должно отдаваться тем методам, которые обеспечивают более высокий уровень безопасности, определяемый методами биотестирования.

В таблице 1 приведены основные характеристики методов биотестирования, рекомендуемых для использования в целях контроля качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения. Описание методов приведено в справочных приложениях, нумерация которых соответствует номерам тест-объектов в таблице 1.

Таблица 1


Тест-объект	Тест-реакция	Способ измерения тест-реакции	Норматив (индекс токсичности)
1. Клеточный тест-объект (гранулиро- ванная сперма быка)	Изменение показателей подвижности тест-объекта	Подсчет числа флуктуаций интенсивности рассеянного излучения, вызванного прохождением тест-объекта через оптический зонд, с использованием автоматической контрольной системы	Допустимые значения индекса токсичности (отношение определяемых значений, характеризующих подвижность тест-объекта в опытном и контрольном растворах): %
2. Инфузории парамеции	Реакция хемотаксиса - число инфузорий, направленно перемещаю- щихся в зоне анализа	Измерение приборами серии "Биотестер" (например, "Биотестер-2"), обеспечивающими регистрацию тест-реакций с выдачей данных в условных единицах токсичности.	Допустимые значения индекса токсичности (допустимая степень загрязнения): ; высокая степень загрязнения:
3. Инфузории тетрахимена- периформис	Изменение выживаемости и интенсивности размножения	Визуальная оценка (подсчет) под микроскопом количества тест-объектов через определенные промежутки времени (15 мин, 1 час, 6 час, 24 часа, 48 часов).	Острое токсическое действие - гибель 100% инфузорий в течение 6 часов. Хроническое токсическое действие при коэффициенте токсичности (снижение числа тест-объектов по сравнению с контролем за 48 часов.) и
4. Штамм бактерий Е-колли	Изменение уровня дегидрогеназной активности микроорганизмов (подавление актив. фермента)	Определение времени обесцвечивания метиленового-синего, как косвенного показателя активности фермента дегидрогеназы.	Признак отсутствия токсичности - отклонение времени обесцвечивания от контрольной пробы меньше, чем на 15%.
5. Ракообраз- ные (дафнии, цеиодафнии)	Изменение показателей выживаемости и плодовитости	Визуальная оценка (подсчёт) количества тест-объектов через определенные промежутки времени в сопоставлении с контрольными пробами.	Острое токсическое действие - гибель более 50% ракообразных за 96 часов. Хроническое токсическое действие - достоверное снижение по сравнению с контролем тест-объектов в течение 20 суток.
6. Водоросли (сценедесмус, хлорелла)	Снижение интенсивности размножения (прироста клеток водорослей)	Визуальная оценка (подсчет) прироста числа клеток в сопоставлении с контрольным опытом.	Показатель токсического действия - достоверное снижение коэффициента прироста числа клеток по сравнению с контролем через 96 часов (острое токсическое действие) и через 14 суток (хроническое токсическое действие)
7.Рыбы (гуппи, данио)	Снижение выживаемости	Визуальная оценка (подсчет) среднего количества тест-объектов, выживших в тестируемой воде в сопоставлении с контрольным опытом	Острое токсическое действие - гибель 50% и более рыб за 96 часов. Хроническое токсическое действие - достоверное снижение выживаемости рыб за 30 суток по сравнению с контрольным опытом

Наряду с перечисленными в таблице 1, практическое применение для оценки качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения находят специальные методы, в частности, для определения суммарной мутагенной активности с использованием биологических тест-систем после проведения соответствующей подготовки. При анализах питьевой воды такая подготовка включает операции экстракции, концентрирования и стерилизации. Для оценки мутагенного потенциала полученных экстрактов наиболее часто применяется тест Эймса (сальмонелла/микросомы) и тесты на индукцию цитогенетических нарушений (хромосомные аберрации, микроядра, сестринские хроматидные обмены). Описание указанных процедур содержится в "Методических указаниях по экспериментальной оценке суммарной мутагенной активности загрязнений воздуха и воды" (Минздрав СССР, М.,1990). Сложность реализации указанных методов обуславливает возможность их применения в специальных лабораториях НИИ, имеющих необходимое оборудование и квалифицированный персонал.

В частности, указанные исследования систематически проводятся в НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина РАМН.

ОБЩИЕ ПРАВИЛА ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ВОДЫ В ЦЕНТРАЛИЗОВАННЫХ СИСТЕМАХ ХОЗЯЙСТВЕННО-ПИТЬЕВОГО ВОДОСНАБЖЕНИЯ

Контроль качества воды в централизованных системах хозяйственно-питьевого водоснабжения включает отбор и анализ проб воды в следующих основных элементах технологической схемы:

- в источнике водоснабжения перед водозабором;

- на промежуточных стадиях процесса водоподготовки (технологический контроль);

- в емкости чистой воды и (или) из трубопроводов перед подачей в водопроводную распределительную сеть;

- в водопроводной сети из распределительных колонок или кранов

Кроме того, в крупных системах водоснабжения силами предприятия водоснабжения проводится контроль поверхностных источников водоснабжения путем отбора проб в различных створах как правило, в пределах зоны санитарной охраны.

С учетом специфики методов биотестирования, связанной с чувствительностью большинства тест-объектов к дезинфектантам, используемым в процессе водоподготовки, а также особенностей отдельных методов биотестирования в отношении сроков получения результатов (возможности реализации экспресс-контроля) и степени универсальности по выявлению различных видов токсикантов в табл.2 изложены рекомендации по предпочтительному использованию различных видов биотестов для контроля качества воды в различных объектах и различных контрольных точках систем водоснабжения.

Таблица 2


Объект контроля	Контрольные точки
Вода в источнике водоснабжения	Контрольные створы в пределах зон санитарной охраны
________________ * На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют СанПиН 2.1.5.980-00 , здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.
		2. Непрерывный оперативный "Алярмконтроль" для своевременного обнаружения внезапного появления в источнике водоснабжения опасных концентраций токсикантов, наличие которых требует принятия специальных мер по дополнительному химическому контролю, очистке воды и (или) предупреждению населения.
		3. Периодический контроль для определения степени опасности воды по совокупному действию находящихся в ней токсикантов.
	зона водозабора	4. Непрерывный оперативный автоматизированный "Алярм-контроль"
		5. Периодический контроль для подтверждения соответствия исходной воды общим требованиям безопасности
Питьевая вода	ёмкости чистой воды и контрольные точки перед входом в систему распределения	6. Периодический контроль после дехлорирования по общему токсическому действию токсикантов, которые могут образовываться в процессе очистки и обеззараживания воды (продукты дезинфекции - галогенорганические соединения и др.)
	водоотборные устройства в сети водоснабжения	7. Периодический контроль проб воды для подтверждения отсутствия токсичного воздействия питьевой воды после прохождения по трубопроводам водопроводной системы.
Материалы, используемые в оборудовании, изделиях и процессах		8. Подтверждение отсутствия токсического эффекта в результате взаимодействия материалов с водой для выдачи разрешений на применение материалов (веществ) в сфере питьевого водоснабжения

В дополнение к рекомендациям, изложенным в табл.2, следует учитывать некоторые изложенные ниже особенности методов биотестирования, связанные с их чувствительностью к отдельным группам токсикантов и возможностями сопоставления фиксируемых результатов тест-реакций с данными стандартизованных методов химико-аналитического контроля.

Для клеточного тест-объекта (гранулированная сперма быка) экспериментально установлены корреляционные зависимости измеряемой тест-реакции от уровня токсикометрических параметров ( - половинная смертельная доза для крыс) и концентраций широкого круга органических токсикантов (хлорированные углеводороды, фенолы, акриламид, формальдегид и др.), которые, в частности, могут попадать в воду при контактах с полимерными материалами и изделиями. Определены предельные значения индекса токсичности, при которых отсутствует реакция лабораторных животных на совокупность различных токсикантов, находящихся в воде в определенных концентрациях. На этой основе данный метод одобрен Минздравом России для оценки полимерных материалов, используемых в медицинской технике. Установлена также чувствительность тест-объекта к тяжелым металлам (ртуть, свинец, кадмий).

Для методов биотестирования с использованием инфузорий установлены данные, характеризующие содержание в воде и концентрации ряда органических и неорганических компонентов, при которых фиксируется тест-реакция, отражающая острое токсическое действие указанных компонентов. На этой основе данный метод может быть рекомендован, в частности, для контроля за качеством воды в водных объектах (источниках водоснабжения), в которых могут содержаться токсичные соединения металлов (ртуть, хром, кадмий, никель, медь, цинк) и органические соединения (хлороформ, бензол, акриламид, винилацетат, метилметакрилат и др.).

При применении в качестве тест-объекта ферментных систем (оценка угнетения дегидрогеназы) выявлена достаточно высокая чувствительность тест-реакций на присутствие в воде повышенных концентраций ионов тяжелых металлов (ртуть, свинец, медь, кадмий), а также ряда органических соединений (фенолы, резорцин, гидрохинон и др.). Специфической особенностью при использовании ферментных тест-систем вместо живых организмов является отсутствие достаточной чувствительности к дыхательным ядам (цианиды), канцерогенам типа бензапирена, а также к некоторым анионам (нитриты, нитраты).

Использование ракообразных, водорослей и рыб в системах биотестирования для определения острого и хронического токсического действия контролируемой воды с соответствующей продолжительностью экспериментов характеризует общий уровень загрязнения воды токсичными компонентами и наличие неблагоприятных факторов, влияющих на жизненные функции организмов. В отношении чувствительности к отдельным токсикантам эти методы относительно менее специфичны по сравнению с применением, например, инфузорий, однако фиксируемые тест-реакции могут проявляться при опасных концентрациях в воде тяжелых металлов (ртуть, хром и др.), фенолов и их производных, отдельных высокотоксичных пестицидов и т.п.

При сопоставлении чувствительности методов биотестирования с методами аналитического химического определения отдельных химических веществ в пробах контролируемой воды отмечается, как правило, невозможность фиксации тест-реакций при низких концентрациях загрязнений воды на уровне ПДК, которые количественно определяются химическими методами.

Реально фиксируемые с необходимой достоверностью тест-реакции при наличии в воде индивидуальных токсикантов для типовых методов биотестирования в режимах экспресс-контроля наблюдаются при концентрациях, существенно превышающих ПДК.

Так, при использовании биотеста с инфузориями острое токсическое действие проявляется при концентрациях, составляющих для никеля - 5 ПДК, хрома и кадмия - 10-20 ПДК, хлороформа - 50 ПДК, бензола - 100 ПДК, фенола - 500 ПДК. Исключение составляет ртуть, для которой острый токсический эффект фиксируется при содержании 1-2 ПДК.

Однако все это относится только к случаям загрязнения воды индивидуальными токсикантами, а основное преимущество методов биотестирования проявляется в фиксации совокупного действия присутствующих в воде токсикантов, когда может иметь место суммирование воздействующих факторов, существенно снижающих уровень обнаружения отдельных токсикантов. При этом возможность экспресс-контроля при применении методов биотестирования с соответствующим приборным оснащением позволяет своевременно выявить возникновение чрезвычайных ситуаций, когда внезапно возникающие высокие уровни загрязнения воды опасными токсикантами могут нанести ущерб здоровью населения в короткие сроки при потреблении небольших количеств воды.

Сводные данные об организациях-разработчиках методов биотестирования, указанных в таблицах 1 и 2, и основных публикациях по этим вопросам, приведены в табл.3.

Таблица 3


NN методик по табл.1 и тест-объекты	Организации-разработчики и консультанты	Литературные источники
1 Клеточный тест-объект (гранулированная сперма быка)	Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники (ВНИИИИМТ), г.Москва; АО "БМК-ИНВЕСТ" г.Москва	Количественный экспресс-метод оценки токсичности питьевой воды, природных вод и промышленных стоков с применением клеточного тест-объекта. А.П.Еськов, Р.И.Каюмов, Ю.С.Ротенберг Биотестирование с помощью суспензии сперматозоидов "Гигиена труда и профессиональные заболевания" N 8, 1989 г.
2 Инфузории парамеции	АО "Квант" г.Санкт-Петербург	Методика определения токсичности проб воды экспресс-методом на приборе "Биотестер" НИИ Гигиены и профпаталогии МЗ СССР, Л-д 1991 А.В.Пожаров, Ю.А.Рахманин, С.А.Шелемотов. Прикладные аспекты аппаратурного биотестирования воды. "Гигиена и санитария" 1994 г.
3 Инфузории тетрахимена периформис	НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина (НИИЭЧиГОС), г.Москва	Методы биотестирования вод, Черноголовка, 1988
4 Штам бактерий Е-колли (фермент дегидрогеназа)	Московский научно-исследовательский институт гигиены им.Ф.Ф.Эрисмана (МНИИГ), г.Москва	Предельно допустимые концентрации вредных веществ в воздухе и воде. Справочное пособие, ГИПХ, Л-д, 1972
5 Ракообразные (дафнии, цериодафнии)	ВНИИВОДГЕО, г.Москва; Гидрохимический институт г. Ростов; Институт биологии внутренних вод РАН (ИБВВ), г.Дубна; ГУАК, Минприроды России, г.Москва	Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-09* Госкомприроды СССР, М.,1991 МС ИСО 6341:1989 "Качество воды. Определение подавления подвижности дафний"
6 Водоросли (сценедесмус, хлорелла)	МГУ, г.Москва	Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-90 Госкомприроды СССР, М.,1991 МС ИСО 6341:1989 "Качество воды. Тест замедления роста пресноводных водорослей"
7 Рыбы (гуппи, данио)	Научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства (ВНИРО), г.Ростов; МГУ, г.Москва	Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-09 Госкомприроды СССР, М.,1991 М.Н.Ильин. Аквариумное рыбоводство, М., изд.МГУ, 1997
8 Сальмонелла (биологические тест-системы для определения мутагенной активности)	НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина, г.Москва	В.В.Соколовский, В.С.Жуков, Ю.А.Рахманин, И.Н.Рыжова. Методические указания по экспериментальной оценке суммарной мутагенной активности загрязнений воздуха и воды, Минздрав СССР, М.,1990; А.М.Фонштейн, С.К.Абилев и др. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем; Методические указания, М., 1985

ПРИЛОЖЕНИЕ 1: БИОТЕСТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОЧНОГО ТЕСТ-ОБЪЕКТА (гранулированная сперма быка)

1. Принцип метода

Принцип метода основан на анализе зависимости показателя подвижности суспензии сперматозоидов от времени и определении подавления их подвижности (сокращения среднего времени подвижности) под воздействием содержащихся в контролируемой воде токсикантов

Сперматозоиды могут существовать вне организма в средах простого состава до нескольких часов без изменений своих функциональных свойств.

Основное назначение половых клеток как носителей наследственной информации - оплодотворение яйцеклетки. Выполнение этой функции определяется их возможностью продвижения к месту оплодотворения, вследствие чего именно подвижность является основным показателем физиологического, биохимического и морфологического статуса сперматозоидов, который оказывается весьма чувствительным к воздействию широкого круга токсикантов.

Реализация метода осуществляется с применением автоматической аналитической системы (комплекса приборов), обеспечивающей сравнительную оценку показателя подвижности суспензии сперматозоидов в опытных (испытуемых) пробах воды и в контрольных средах, определение процедур расчетов и выдачу результатов в виде соответствующих индексов токсичности оцениваемых проб воды.

Оцениваемый системой показатель подвижности () определяется как функция концентрации подвижных клеток и среднего модуля их скорости

Где - коэффициент, связанный с конструкцией измерительной системы.

Оценка показателя подвижности осуществляется путем автоматического подсчета числа флуктуаций интенсивности рассеянного излучения, вызванного прохождением клеток через оптический зонд.

2. Тест-объект

В качестве тест-объекта используются сперматозоиды быка. Сперму получают на станциях искусственного осеменения в виде гранул, замороженных в жидком азоте. В замороженном виде в сосуде Дьюара с жидким азотом сперму можно хранить неограниченно долго.

Долив азота (4-5 литров) производят каждые 4-5 дней.

Коэффициент вариации концентрации сперматозоидов в гранулах спермы не превышает 10%, что обеспечивает достаточную стабильность и воспроизводимость в экспериментах по оценке их подвижности в контролируемых водных средах.

3. Аналитическая система

Аналитическая система включает комплекс приборов, в состав которого входит анализатор токсичности, блок подготовки образцов и компьютер с принтером, обеспечивающие автоматическое проведение оценки контролируемой тест-реакции, обработку результатов сравнительной оценки подвижности и выдачу итоговых данных в виде соответствующих распечаток.

Технические характеристики системы:

- длина волны лазерного излучения - 0,63 мкм;

- мощность лазерного излучения - не менее 1 мВт,

- время одного анализа - от 10 до 300 с с шагом 10 с;

- время перемещения кюветы (капилляра) с образцом - не более 2 с;

- время обратного хода каретки - не более 15 с;

- температура проб и рабочих образцов - 35-45 °С;

- допустимые пределы отклонения от установленной температуры - ±1,5 °С;

- объем кюветы (капилляра) с контролируемым образцом - 25 мкл;

- компьютер типа IBM PC AT (и последующие модели).

Блок-схема системы приведена на рис.1

Блок-схема комплекса

Рис.1. Блок-схема системы

1 - капилляр, 2 - каретка, 3 - привод, 4 - блок термостатирования капилляров, 5 - лазер, 6 - светоделительная пластина, 7 - микрообъектив, 8 - светоделительная пластина, 9 - экран, 10 - маска, 11 - фотодиод, 12 - усилитель, 13 - контроллер, 14 - компьютер, 15 - принтер, 16 - блок подготовки проб и рабочих образцов

Конструктивное исполнение системы обеспечивает возможность визуального наблюдения за клеточными тест-объектами в суспензии.

4. Вспомогательное оборудование, материалы, реактивы

Вспомогательное оборудование, материалы и реактивы включают:

- комплект кювет (капилляров) для помещения контролируемых образцов в аналитическую систему;

- пробирки с притертыми пробками по ГОСТ 1770-74 объемом 3-5 мл - 40шт.;

- пипеточные дозаторы объемом 0,2 мл и 0,5 мл;

- колбы мерные с притертыми пробками объемом 1000 мл - 2шт.;

- колбы конические с притертыми пробками объемом 50 мл и 100 мл - по 10 шт., объемом 500 мл и 1000 мл - по 2 шт.;

- весы торсионные типа ВТ-500;

- пинцет анатомический;

- сосуд Дьюара емкостью 26,5 л марки СДП-25 - 2 шт.;

- сосуд Дьюара емкостью 5 л марки СДС-5 - 1 шт.;

- шкаф сушильный;

- холодильник бытовой;

- сперма быка в гранулах, замороженная при температуре жидкого азота;

- азот жидкий;

- цитрат натрия кристаллический, х.ч.;

- глюкоза кристаллическая;

- спирт этиловый;

- вода дистиллированная;

- бидистиллят.

5. Условия и процедура биотестирования

5.1. Температура рабочих сред при проведении биотестирования должна поддерживаться в пределах 40±1,5 °С. Это достигается автоматическим термостатирующим устройством.

5.2. Проведение испытаний

5.2.1. Включают аналитическую систему нажатием тумблера "Сеть" за 30 мин до начала испытаний. С помощью компьютера задают условия проведения испытаний: температуру, время одного анализа, количество кювет (капилляров) с образцами. Информация о достижении необходимой температуры и готовности системы к работе выдается на дисплей.

5.2.2. Готовят опытные и контрольные растворы. В качестве контрольного раствора применяют глюкозо-цитратную среду состава: глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, вода дистиллированная - 100 мл. Контрольная среда одновременно является разбавителем для оттаивания замороженной спермы. Изотонию опытного (испытываемого) раствора (проб воды) достигают путем добавления сухих реактивов: 4 г глюкозы и 1 г цитрата натрия на 100 мл воды. Вместо дистиллированной воды может быть использована "фоновая" проба воды из источника с известными показателями химического состава, отвечающими требованиям безопасности.

5.2.3. Дозируют по 1 мл контрольного и испытываемого раствора в пробирки и помещают в водный термостат для термостатирования при температуре 40±1,5 °С.

5.2.4. Для оттаивания замороженной спермы отмеривают в пробирки по 0,5 мл разбавителя (по п.5.2.2) и термостатируют их при температуре 40±1,5 °С. Охлажденным анатомическим пинцетом извлекают из сосуда Дьюара гранулу спермы и быстро опускают в нагретый раствор. Каждую гранулу размораживают в отдельной пробирке. Сразу после размораживания спермы содержимое пробирок сливают в одну пробирку и тщательно перемешивают. Смесь термостатируют при 40±1,5 °С.

5.2.5. Рабочие образцы для биотестирования в аналитической системе готовят путем внесения в каждую пробирку с контрольным и испытываемым растворами по 0,2 мл суспензии сперматозоидов (по п.5.2.4).

5.2.6. Для проведения анализов рабочие образцы из пробирок с контрольным и испытываемым растворами (по п.5.2.5) переносят в капилляры, выполняющие функции кювет, и герметизируют их путем поочередного окунания концов капилляров в ванну с парафином.

Капилляры с рабочими образцами помещают на каретку и устанавливают в привод аналитической системы.

С помощью компьютера проводят идентификацию капилляров и запускают процесс накопления экспериментальных данных. Процесс продолжают до достижения нулевых значений показателя подвижности во всех капиллярах, после чего проводят математическую обработку результатов по алгоритмам, реализуемым программой компьютера согласно изложенным ниже методическим положениям.

6. Обработка и оценка результатов

6.1. В результате эксперимента в системе для каждого образца биотестируемых растворов (испытываемых и контрольных проб воды) регистрируется зависимость:

где - показатель подвижности (по п.1),

- время

7.6.2. Для каждой из указанных зависимостей вычисляется средневзвешенное значение времени подвижности ,

Где - -ое значение показателя подвижности,

- текущий номер оценки показателя подвижности.

6.3. Для контрольной и опытной выборок образцов вычисляют среднее арифметическое значение и среднее квадратическое отклонение, по которым в свою очередь рассчитывают для каждой выборки коэффициент вариации , по формуле:

Где - среднее квадратическое отклонение,

- среднее арифметическое значение

В случае получения коэффициента вариации более 15% хотя бы для одной из выборок, повторяют эксперимент. Если значение коэффициента вариации для каждой из выборок меньше или равно 15%, то результаты контроля считают достоверными.

6.4. Вычисление индекса токсичности проводится по формуле:

Где и - средние арифметические значения средневзвешенного времени подвижности, соответственно, для опытной и контрольной выборок образцов.

6.5. Критерием отсутствия токсического воздействия является нахождение величин в интервале значений от 70 до 130%.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2: БИОТЕСТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНФУЗОРИЙ PARAMECIUM

1. Принцип метода

Методика биотестового анализа водных проб основана на способности Paramecium caudatum - инфузории туфельки (далее - инфузории) избегать неблагоприятных и опасных для жизнедеятельности зон и активно перемещаться по градиентам концентраций химических веществ в зоны благоприятные (реакция хемотаксиса). Методика позволяет оперативно определять острую токсичность водных проб.

2. Характеристика тест-объекта, выращивание и подготовка культуры к анализу

2.1. В качестве тест-объекта используется Paramecium caudatum - инфузория туфелька. Относится к подцарству простейших (одноклеточных животных) - Protozoa, типу - Ciliophora. Инфузория широко распространена в пресных водоемах. Форма клетки эллипсоидная, размеры - 200х40 мкм. Основную пищу инфузории составляют бактерии, дрожжи и т.п. Размножение инфузории происходит путем поперечного деления клетки. В зависимости от условий выращивания время генерации может составлять от нескольких часов до нескольких суток.

По сравнению с другими группами простейших инфузории имеют наиболее сложное строение и отличаются разнообразием функций. Инфузория находится в непрерывном движении. Скорость ее при комнатной температуре - 2,0-2,5 мм/с. Траектория движения сложная: она движется вперед, вращаясь вдоль продольной оси тела, с помощью ресничек, количество которых достигает 10-15 тысяч. Изменение внешних условий (температура, химический состав среды, электромагнитные колебания и другие факторы) воспринимаются клеткой, и первая ответная реакция - изменение характера движения: уменьшение или увеличение скорости, частоты остановок и разворотов, разнообразные таксисы, например, гео-, магнито-, аэро-, хемотаксис.

2.2. Исходный материал для выращивания культуры инфузории передается при поставке прибора "БИОТЕСТЕР-2". Культуру можно также получить из коллекций культуры простейших, имеющихся в различных научных организациях (например, в БиНИИ СПб ГУ: 198904; Старый Петергоф, Ораниенбаумское шоссе, 2). Можно выделить свою культуру из местных водоемов или приобрести у аквариумистов, но необходимо при этом учитывать, что видовую принадлежность может определить специалист-протозоолог, т.к. существуют другие представители рода Paramecium caudatum.

2.3. Выращивание культуры

2.3.1. В данной методике может быть использована культура инфузории, выращенная по различным методикам, которые обеспечивают получение тест-объекта, во-первых, в достаточном для анализов количестве, во-вторых, чувствительного к модельному токсиканту в пределах концентраций, установленных в п.2.3.

Выращивание культуры проводят в любых удобных сосудах, например, в стеклянных колбах, стаканах, чашках Петри и других. В качестве корма используют бактерии, дрожжи и их смесь, выращенные стерильно на твердых средах. При отсутствии условий для выращивания стерильного корма, можно использовать воздушносухие пекарские дрожжи.

К общим положениям по выращиванию культуры относится обязательное требование идентичности среды выращивания и среды, которая будет использована для процедур отмывания культуры от продуктов метаболизма, получения рабочей взвеси, разведения водных проб и прочих процедур с культурой.

Метод культивирования инфузории приведен ниже в качестве примера.

2.3.2. Метод культивирования инфузории

В широкогорлую коническую колбу на 200 мл вносят суспензию инфузорий в среде Лозина-Лозинского в количестве 100 мл с плотностью 1000±200 клеток/мл. В качестве корма добавляют воздушносухие дрожжи из расчета 1 мг на 1 мл среды. Выращивание ведут при температуре 18-26 °С.

Для биотестового анализа используют культуру в начале стационарной фазы роста. Для контроля за развитием популяции отбирают ежесуточно пробу, в которой определяют количество клеток по п.2.3.4.1. Отсутствие прироста клеток в популяции свидетельствует о наступлении стационарной фазы роста, ежесуточный контроль позволяет определить ее начало. Обычно при заданных в начале данного раздела условиях стационарная фаза роста наступает на 2-3 сутки, при этом плотность культуры будет составлять 4000±1000 клеток/мл.

2.3.3. Поддержание и хранение культуры

При перерывах в проведении биотестовых анализов культуру достаточно поддерживать только как посевной материал. Один из способов поддержания - на зернах риса. В чашку Петри помещают 2-3 сырых зернышка риса, добавляют среду около 30-40 мл и помещают клетки инфузории туфельки в количестве 50-100 клеток/мл. Раз в 2 недели меняют среду и зерна риса.

Удобно содержать резервную культуру в пробирках. Один раз за 7-10 суток концентрат клеток из верхней части пробирки (без перемешивания) переливают в другую пробирку, добавляют среду Л-Л до прежнего объема и по 0,5 мг дрожжей на 1 мл жидкости.

Другой способ консервации культуры - хранение в холодильнике при низких положительных температурах. Скорость деления при этом может составлять одно деление в 10-20 суток. Культуру отмывают от продуктов метаболизма и старого корма, доводят концентрацию взвеси до 200±100 клеток/мл, добавляют сухие дрожжи 0,2 мг/мл и помещают в холодильник. Так культура сохраняется до месяца. При использовании культуры, сохранявшейся в холодильнике, необходимо дождаться выравнивания ее температуры с температурой остальных растворов и только после этого производить необходимые процедуры.

Особое внимание следует обратить на то, что инфузория не выдерживает резких перепадов температуры (!).

2.3.4. Определение концентрации взвеси инфузории

Концентрацию клеток необходимо определять в процессе выращивания культуры, при подготовке рабочей взвеси клеток и для определения величины тест-реакции. Определение концентрации клеток инфузорий без затруднений выполняется с помощью отградуированного прибора серии "Биотестер".

2.3.4.1. В общем случае концентрацию клеток инфузории определяют подсчетом клеток под микроскопом по общепринятым в микробиологической практике методикам: с помощью измерительных сеток, счетных камер и т.п. Подсчитанное количество клеток пересчитывают на единицу объема среды и выражают как концентрацию (клеток/мл). Ниже приводится пример способа подсчета клеток инфузорий. Исходную взвесь инфузорий взболтать, отобрать с помощью пипетки 0,5 мл взвеси. К этому объему добавить 9,5 мл 1% раствора NaCI. Таким путем достигается обездвиживание инфузорий. Не дожидаясь полного обездвиживания инфузорий (примерно через 2-5 мин) из разбавленной взвеси отбирают 0,5 мл и распределяют этот объем в виде 6-10 крупных капель на сухом стекле (например, в чашке Петри). С помощью микроскопа (лупы) подсчитывают инфузории во всех каплях. Полученный результат пересчитывают на 1 мл исходной взвеси.

Например: 0,5 мл взвеси обездвиженных инфузорий распределены в 6 каплях, в которых было сосчитано 29, 38, 32, 31, 28, 35 клеток - всего 193. В 1 мл разбавленной взвеси содержится 386 клеток, а в 1 мл исходной взвеси, следовательно, будет содержаться 3860 клеток инфузорий.

2.3.4.2. Специализированным средством для определения количества подвижных клеток инфузории является прибор серии "Биотестер". Определение концентрации подвижных клеток проводят по предварительно построенной градировочной кривой.

Для построения градировочной кривой берут взвесь клеток инфузории в среде Л-Л по п.2.3.2. Из взвеси готовят ряд разведений, каждое из которых по концентрации меньше предыдущего в 2 раза, объем взвеси каждого разведения не менее 5 мл. Последнее разведение может содержать 5-10 кпеток/мл. Исходную концентрацию клеток определяют подсчетом числа клеток под микроскопом (см.п.2.3.4.1). Концентрации клеток в серии разведений определяют соответствующим расчетом. При этом последовательно определяют концентрацию подвижных клеток инфузорий, находящихся в исходной рабочей взвеси и во всех разведениях, снимая показания на приборе. Для этого заполняют кювету контролируемой взвесью клеток до верха (инфузории не обездвиживать!), помещают в кюветный модуль прибора и снимают ряд показаний.

Процедуру подсчета клеток в исходной взвеси, приготовление разведений, измерение на приборе исходной взвеси и разведений повторяют не менее 3 раз и результаты усредняют. По полученным данным строят градировочную кривую как зависимость показаний прибора от логарифма концентрации клеток. Построенная кривая может быть использована продолжительное время с одним и тем же измерительным прибором.

2.4. Подготовка инфузорий к анализу

2.4.1. Выращенную по п.2.3 культуру инфузории отмывают от продуктов метаболизма и корма, доводят концентрацию до рабочего значения, проводят проверку готовности культуры к анализу по ее чувствительности к модельному токсиканту и по ее способности выходить в чистую пробу.

2.4.2. Отмывание культуры

При отмывании используют нормальную физиологическую реакцию инфузорий собираться в верхних слоях жидкости. Использование сосудов с узким длинным горлом позволяет сконцентрировать инфузории в верхней зоне и слить в другой сосуд с минимальным количеством загрязненной культуральной среды. Концентрат разбавляют чистой средой Л-Л, опять собирают клетки в верхней зоне и сливают. В результате отмывания инфузорий степень разбавления культуральной жидкости чистой средой должна быть не менее 1:200.

Пример. Культура выращена на среде Л-Л. Отмывочная среда - Л-Л. К 50 мл культуры добавляют 50 мл среды Л-Л, тщательно переливают в мерную колбу на 100 мл, обязательно заполняя горлышко. Через 5-15 минут инфузории собираются в верхней зоне. Сливают верхнюю часть жидкости из колбы. Получают взвесь клеток с разбавлением культуральной жидкости в два раза и объемом, например, 20 мл. Процедуру по отмыванию повторяют еще 2 раза, добавляя к 20 мл взвеси 80 мл среды Л-Л и получают взвесь клеток, например, в объеме 10 мл с разбавлением исходной взвеси инфузорий в 50 раз. Доводят объем полученной взвеси (10 мл) и получают разведение в 250 раз. Определяют концентрацию клеток в полученной взвеси по п.2.3.4 и доводят ее до значения 1000±200 кл/мл. Полученную рабочую взвесь клеток инфузорий после предварительной проверки используют в течение 1,5 часов.

2.4.3. Проверка готовности взвеси инфузорий к анализу

Проверку проводят по двум параметрам одновременно:

- по степени выхода инфузорий в контрольную чистую пробу;

- по чувствительности к модельному токсиканту.

2.4.3.1. Для проверки выхода инфузорий в контрольную пробу заполняют по п.4.1 три кюветы взвесью клеток, наслаивают среду Л-Л или заведомо нетоксичную воду (но не дистиллят). Через 30 минут измеряют концентрацию клеток в верхних зонах кювет по п.4.2. Усредняют результат по 3 кюветам и определяют готовность тест-культуры к биотестовому анализу по условию: выход должен быть не менее 70% от концентрации рабочей взвеси.

2.4.3.2. Для проверки чувствительности к модельному токсиканту в три кюветы наслаивают раствор сульфата меди с концентрацией 0,1 мг/л, приготовленный по п.3.4. Через 30 минут измеряют концентрацию в верхних зонах кювет по п.4.2 и рассчитывают индекс токсичности к раствору сульфата меди.

При культуру используют в биотестовом анализе.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, растворы.

3.1. Средства измерений:

- микроскоп бинокулярный с увеличением порядка 10-50;

- прибор серии БИОТЕСТЕР, например, БИОТЕСТЕР-2 - специализированный импульсный фотометр по ТУ 401-51-005-91* с набором фотометрических кювет;
________________
* ТУ, упомянутые здесь и далее по тексту, не приводятся. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке . - Примечание изготовителя базы данных.

- весы лабораторные общего назначения (ГОСТ 8.520-84).

3.2. Вспомогательные устройства:

- сосуды для культивирования из химически инертного материала, например, химические стаканы, конические широкогорлые колбы, чашки Петри (ГОСТ 25336-82);

- пипетки, мерные колбы, пробирки (ГОСТ 20292-74 , 1770-74).

3.3. Материалы:

- соли марки ч.д.а. или х.ч.: натрий хлористый, калий хлористый, кальций хлористый, магний сернокислый, натрий углекислый кислый, медь сернокислая пятиводная;

- поливиниловый спирт ПВС - марка 11/2, высший сорт (ГОСТ 10779-78);

- дрожжи хлебопекарные воздушносухие - используются в качестве корма для инфузорий.

3.4. Растворы:

- взвесь клеток инфузорий, полученная путем выращивания тест-объекта в определенных условиях (см.п.2.3), отмытая от продуктов метаболизма и корма (см.п.2.4) и доведенная до рабочей концентрации (плотности) 1000±200 клеток/мл;

- среда для культивирования и разбавления: готовится на дистиллированной воде (среда Лозина-Лозинского, в дальнейшем Л-Л). Возможно использование водопроводной воды, которая должна быть соответствующим образом обработана (дехлорировать и отстоять в течение 5-10 суток).

Для приготовления концентрата среды Л-Л в 1 л воды растворяют следующие соли (марки ч.д.а. или х.ч.): NaCI - 1,0 г, KCI - 0,1 г, MgSO - 0,1 г, CaCIx2HO - 0,1 г, NaHCO - 0,2 г. Такой раствор можно хранить в холодильнике до 7 суток. Для работы используется среда Л-Л, полученная десятикратным разбавлением исходного концентрата. Разбавляющая среда и среда для культивирования должны быть идентичны и обеспечивать выживаемость инфузории в течение 5 суток;

- модельный токсикант на основе сульфата меди. Маточный раствор сульфата меди (10 мг/л) в дистиллированной воде хранят не более недели. Рабочие концентрации сульфата меди готовят перед самым определением. Растворы соли с концентрациями до 1 мг/л готовят в дистиллированной воде, а с концентрациями 0,1 мг/л и меньше - в среде Л-Л;

- раствор ПВС в среде Л-Л: 5% раствор используют в качестве нейтрального загустителя. Для приготовления раствора ПВС 0,5 г порошка ПВС смешивают с 9,5 мл среды Л-Л. Смесь нагревают на водяной бане до растворения порошка. Используют раствор в течение суток.

4. Метод определения

4.1. Метод определения токсичности жидких сред основан на способности тест-объектов реагировать на появление в водной среде веществ, представляющих опасность для их жизнедеятельности, и направлено перемещаться по градиенту концентраций этих веществ (хемотаксическая реакция), избегая их вредного воздействия.

Хемотаксическая реакция реализуется при условии наличия стабильного и воспроизводимого градиента концентраций химических веществ. Подобный градиент создается путем наслоения в вертикальной кювете (пробирке) на взвесь инфузорий в загустителе испытуемой водной пробы. При этом в измерительной кювете образуется стабильная граница, сохраняемая в течение всего времени биотестирования. Эта граница раздела не препятствует свободному перемещению инфузорий в предпочтительном для них направлении и при этом предотвращает перемешивание жидкостей из нижней и верхней зон.

После создания в кювете двух зон в течение 30 минут происходит перераспределение инфузорий по зонам. Важная особенность поведенческой реакции инфузорий - массовое перемещение клеток в верхние слои жидкости. В случае, если исследуемая проба не содержит токсических веществ, в кювете будет наблюдаться концентрирование клеток инфузорий в верхней зоне. Наличие в исследуемой пробе токсических веществ приводит к иному характеру перераспределения инфузорий в кювете, а именно, чем выше токсичность пробы, тем меньшая доля инфузорий перемещается в верхнюю зону (исследуемую пробу).

4.2. Критерием токсического действия является значимое различие в числе клеток инфузорий, наблюдаемых в верхней зоне кюветы в пробе, не содержащей токсических веществ (контроль), по сравнению с этим показателем, наблюдаемым в исследуемой пробе (опыт)

4.3. Количественная оценка параметра тест-реакции, характеризующего токсическое действие, производится путем расчета соотношения числа клеток инфузорий, наблюдаемых в контрольной и исследуемой пробе (согласно п.8.1), и выражается в виде безразмерной величины - индекса токсичности (Т).

5. Условия определения

5.1. Определение токсичности по настоящей методике выполняется оператором с квалификацией лаборанта.

5.2. На методику распространяются общие правила техники безопасности при работе с химическими реактивами общего применения и лабораторной аппаратурой (указаны в паспорте на прибор).

5.3. Инфузории работают в интервале температур 10-30 °С при соответствии их свойств требованиям п.2.3.

6. Подготовка к выполнению определения

6.1. Отбор и хранение проб

Общие процедуры отбора проб определены в следующих документах: ИСО 5667/2. Качество воды. Отбор проб. ч.2; ГОСТ 24481-80 . Вода питьевая. Отбор проб.

6.2. Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 часов после их отбора. При невозможности проведения анализа в указанный срок пробы воды охлаждают (+4 °С). Не допускается консервирование проб с помощью химических консервантов.

6.3. Необходимый для выполнения анализа (в трех повторностях) объем водной пробы составляет около 10 мл. Для однократного определения достаточно 2 мл.

6.4. При проведении биотестирования температура исследуемой пробы должна соответствовать температуре взвеси тест-объекта. Инфузории не переносят резких перепадов температуры (!).

6.5. При наличии в пробе крупнодисперсных включений, соизмеримых по величине с клеткой инфузории или больших по размеру, необходима фильтрация пробы.

7. Проведение анализов

7.1. Заполнение кювет

В кювету вносят 2,0 мл взвеси инфузорий в рабочей концентрации, предварительно проверенной по двум параметрам: по чувствительности к модельному токсиканту (см.п.2.4.3.2) и по выходу в разбавляющую среду (см.п.2.4.3.1). К взвеси добавляют 0,35 мл 5% раствора ПВС, все тщательно перемешивают, непременно увлажнив стенки кюветы, и наслаивают (например, пипеткой) 1,8 мл анализируемой водной пробы, не допуская перемешивания с нижним слоем. Через 30 минут (продолжительность тест-реакции) последовательно производят определение концентрации инфузорий в верхней зоне кюветы в контрольных () и опытных () пробах. Контрольные и опытные пробы готовят одновременно.

7.2. Измерение концентрации инфузорий на приборе "БИОТЕСТЕР-2"

Подготовленные по п.7.1 кюветы последовательно помещают в кюветный модуль и снимают показания прибора. В приборе "БИОТЕСТЕР-2" предусмотрено три режима работы:

- измерение и индикация результата через каждые 22 с;

- измерение и индикация среднего значения результатов 5 отсчетов (через каждые 110 с);

- измерение и индикация среднего значения результатов 10 отсчетов (через каждые 220 с).

Работа с прибором:

а) установить режим усреднения "1" (горит светодиод над кнопкой, соседние светодиоды погашены);

б) вставить кювету в кюветную нишу, закрыть крышку, нажать кнопку "ПУСК";

в) индикация гаснет, на 12 с (время автоподстройки) загорается светодиод "ОТСЧЕТ", и еще через 22 с на индикационном табло появляется первое значение концентрации в условных единицах. Выдача отсчета сопровождается световым и звуковым сигналом продолжительностью 2 с;

г) в течение 22 с значение предыдущего отсчета сохраняется, этого времени достаточно для регистрации результата.

Если концентрация токсикантов настолько велика, что инфузории практически не выходят в пробу (показания прибора в условных единицах находятся в пределах 000-008), то начинает мигать светодиод "ТРЕВОГА". Это означает, что испытуемую пробу необходимо разбавить до получения на приборе значимых величин. (Не забудьте скорректировать оценку токсичности в соответствии со степенью разбавления исходной пробы).

Последовательность операций при использовании других режимов измерений идентична вышеописанной. Обычно работают в режиме усреднения по 5 показаниям. Контрольные и испытуемые пробы делают в трех повторностях. Значения повторностей усредняют и рассчитывают индекс токсичности по п.8.1.

8.Обработка и оформление результатов

8.1.Оценку токсичности водной пробы производят по относительной разнице количества клеток в верхних зонах кювет с контрольными и анализируемыми пробами.

Индекс токсичности определяется как:

где , - средние показания прибора для контрольных и анализируемых проб соответственно.

Индекс токсичности () - величина безразмерная и может принимать значения от 0 до 1 в соответствии со степенью токсичности анализируемой пробы.

По величине индекса токсичности анализируемые водные пробы классифицируются по степени их загрязнения на 4 группы:

I. Допустимая степень загрязнения ();

II. Умеренная степень загрязнения ();

III. Высокая степень загрязнения (, а также значимые значения , полученные при 2-х, 4-х, 6-кратном разбавлении анализируемой пробы);

IV. Чрезвычайно высокая степень загрязнения (значимые значения , полученные при 8-кратном и свыше разбавлении анализируемой пробы).

8.2. Пример записи результатов измерений


Номер пробы	Пов- тор- нос- ти	Показания прибора I у.е.		Ср.знач. по 5 изме- рениям , у.е.	Ср.знач. по 3 пов- торнос- тям 4 ср.у.е.	Индекс токсичности , у.е.
Контроль среда Л-Л


Проба 1			[email protected] Если процедура оплаты на сайте платежной системы не была завершена, денежные средства с вашего счета списаны НЕ будут и подтверждения оплаты мы не получим. В этом случае вы можете повторить покупку документа с помощью кнопки справа. Произошла ошибка Платеж не был завершен из-за технической ошибки, денежные средства с вашего счета списаны не были. Попробуйте подождать несколько минут и повторить платеж еще раз.